Určování struktur nečistot a jejich izolace

Identifikace a určení struktury nečistoty je poměrně častý úkol, se kterým se musíme vypořádat. Všechny neznámé nečistoty s obsahem vyšším, než dovoluje platná legislativa (zpravidla 0.1 %) jsou pro zákazníka potenciální komplikací, protože mohou vyvolat nežádoucí zájem při registračním řízení.

Znalost struktury neznámé nečistoty je potom často klíčová při odlišení nečistot pocházejících z výrobního postupu od nečistot vznikajících následnou degradací finálního produktu. Prvně jmenované nečistoty lze dostat pod kontrolu například úpravou výrobního postupu. Při znalosti struktury nečistoty degradačního původu lze zase cíleně připravit její standard a na základě toxikologických dat, popřípadě zvýšit limit pro její obsah.

V praxi používáme při určování struktury látek hmotnostní spektrometrii v tandemu buď s plynovou (GC-MS) nebo kapalinovou chromatografií (LC-MS). Pro určování struktury těkavých látek se nám osvědčilo použití GC-MS systému s jednoduchým kvadrupólem, který nicméně poskytuje při použití EI ionizace dostatečné množství informací vedoucích k cílové struktuře. Při interpretaci spekter lze také často s úspěchem využít i digitální knihovnu hmotnostních spekter (NIST).

Dlouholeté zkušenosti ukázaly, že pro identifikaci většiny netěkavých organických nečistot je nejlepší volbou použití LC-MS systému s ESI nebo APCI ionizací a iontovou pastí. LC/MS systém LTQ (Thermo-Finnigan), který k tomuto účelu využíváme je vybavený lineární iontovou pastí, která spojuje výhody klasické iontové pasti s možnostmi MSn a citlivosti kvadrupólu. Výhodou je především vysoká citlivost, rychlost sběru dat a díky ortogonální konstrukci iontového zdroje i odolnost vůči kontaminaci například složkami matrice nebo částečně i netěkavým složkám v mobilní fázi.

Pokud samotné LC/MS nestačí, jsme schopni požadované nečistoty izolovat pomocí preparativní kapalinové chromatografie a zajistit například měření potřebných NMR spekter, které potom umíme sami interpretovat.

V návaznosti na identifikaci nečistoty např. pomocí LC/MS jsme schopni danou látku na přání zákazníka chromatograficky izolovat ve větším množství. Míra úspěchu záleží na míře separace kýžené komponenty od zbytku směsi, ale především na jejím obsahu v surovém materiálu. Pokud je obsah příliš nízký, hledáme cesty k jeho nabohacení a to buď vhodně zvolenými zátěžovými podmínkami nebo předseparací.

Izolace může být užitečná ve chvíli, kdy buď není snadné látku cíleně připravit, nebo je potřeba pro její identifikaci využít i jiné techniky než LC/MS (například NMR).

Pro tyto účely využíváme buď klasické sloupcové chromatografie nebo vysokoúčinné separace na automatizovaném semipreparativním modulárním HPLC systému Waters. Pomocí těchto technik jsme schopni izolovat, v závislosti na koncentraci v surové směsi a kvalitě separace jednotlivé komponenty v množství cca desítek až stovek mg.

Syntéza a certifikace referenčních materiálů

V návaznosti na předchozí bod týkající se určování struktur nečistot často vyvstává potřeba získat danou látku jako analytický standard v dostatečném množství tak, aby bylo možno tuto nečistotu rutinně stanovovat příslušnými metodami v produktu.

Naší výhodou je, že již během procesu identifikace struktury často vyvineme postupy, jimiž lze danou látku cíleně vyrobit synteticky působením vhodných činidel např. na účinnou látky nebo ji aspoň nabohatit.

Díky tomu dokážeme často získat požadovanou látku rychleji než za pomoci klasických syntetických postupů, které ale ve vhodných případech využíváme také částečně ve spolupráci s externími syntetickými laboratořemi.

Další výhodou je, že riziko neshody mezi původně navrženou strukturou nečistoty a její skutečnou strukturou neseme sami, což ve výsledku může představovat nemalé úspory času a peněz na straně zákazníka.

Samozřejmostí je, že sami navrhneme a provedeme certifikaci daného analytického standardu včetně plné charakterizace struktury,  stanovení potence a vydání analytického certifikátu.

Zrychlené stabilitní a degradační studie

Součástí validace většiny HPLC metod pro stanovení obsahu nečistot je tzv. degradační studie (FDS z angl. Forced Degradation Study). FDS je nástroj pro hodnocení analytických metod, které aspirují na označení „stabilitně-indukující“. Principem FDS je vystavení dané účinné látky resp. léčivého přípravku (a příslušného placeba) sérii fyzikálních a chemických zátěží, jejichž působením se mohou v krátké době generovat dosud neznámé nečistoty, které se mohou potenciálně vyskytnout ve finálním produktu během skladování. Fyzikální a chemickou zátěží se rozumí zejména:

• Působení tepla
• Vystavení světelnému záření (UV/VIS)
• Kyselá, alkalická a oxidační zátěž
• Působení zvýšené teploty a vlhkosti prostředí

Zejména u chemických zátěží je pro volbu optimálních podmínek výhodou dobrá znalost chemického chování zkoumané účinné látky.  Případné interakce účinné látky s excipienty se zvlášť studují v rámci tzv. kompatibilitních studií.  Zkušenost ukázala, že tento typ práce je spíše doménou R&D, které provádí zrychlené stabilitní, degradační a kompatibilitní studie jako rutinní součást vývoje nových analytických metod, ale i jako podporu formulačního vývoje daného léčivého přípravku.

Stopová analýza pomocí GC/MS a LC/MSS

Máme bohaté zkušenosti s vývojem metod pro stanovení stopových množství sledovaných nečistot. Pro naše zákazníky obvykle vyvíjíme metody pro stanovení toxických nečistot na hladinách násobně nižších, než požadují příslušné regulační autority. Přestože se nezřídka jedná o analyty reaktivní a často v nepříznivé kombinaci se špatně rozpustnou nebo reaktivní matricí, vždy jsme zatím dosáhli požadovaného detekčního limitu.

Pro tyto účely využíváme nejčastěji techniku LC/MS na systémech sestávajících z HPLC 2690 či UHPLC Acquity (obojí Waters) a hmotového spektrometru LTQ(Thermo-Finnigan) nebo GC/MS na systému 7890A/5975C (Agilent Technologies). Na všech těchto přístrojích běžně dosahujeme kvantifikační limity v jednotkách ppm, což je pro farmaceutické účely většinou zcela dostatečné.

V případě potřeby využíváme i jiné přístrojové vybavení společnosti čítající několik LC/MS systémů vybavených hmotnostními i spektrometry s trojitým kvadrupólem či HR-MS systému OrbiTrap (Thermo).